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Qiagen DNeasy Tissue Kit を用いた DNA 抽出 -Part2-

吉澤和徳（北大・農・昆虫体系）

2005.3.3

用途：シーケンス解析

○試薬

• ATL buffer（キット付属）
• AL buffer（キット付属）
• AW1 buffer（キット付属：規定量の 99.5% EtOH を加えておく）
• AW2 buffer（キット付属：規定量の 99.5% EtOH を加えておく）
• AE buffer（キット付属）
• Proteinase K（キット付属）
• 99.5% EtOH

○プロトコル

1. サンプル一個体を「解剖せずに」 1.5 ml チューブに入れ，180 ul の ATL buffer を加える．
2. 20 ul の Proteinase K を加え，voltex した後，55C で二晩培養する．培養中，数度 voltex する（最低，培養開始１時間後，３時間後，翌朝：ローターで回し続ければベスト）．
3. 200 ul の AL buffer を加えて 10 秒間 voltex した後，70C で 10 分間培養する．
4. 210 ul の 99.5 % EtOH を加え，30 秒間 voltex する．
5. QIAamp spin column を添付の 2 ml collection tube に立て，溶液を移す．この際，1.5 ml チューブにサンプルの外骨格を残しておき，証拠標本としてプレパラートを作成する．
6. ６の 2 ml collection tube を 8000rpm で 1 分間遠心する．
7. collection tube を交換し，spin column に 500 ul の AW 1 buffer を加え，8000 rpm で 1 分遠心．
8. collection tube を交換し，spin column に 500 ul の AW 2 buffer を加え，15000 rpm で 3 分遠心．
9. spin column を 1.5 ml チューブに立て， AE buffer を 30 - 100 ul 加え，8000rpm で 1 分間遠心し，DNA を溶出する．

○ぽいんと

• 要はこの方法とほとんど同じなのですが，解剖する必要がない，ってところが味噌．
• チャタテムシ（コナチャタテのような超微小のものを含む）やジュズヒゲムシの抽出は，この方法で全く問題ありません．シラミではやや成績が悪いので，外骨格の厚さや，口や肛門の大きさ（ここら辺からDNAが溶け出してる）などが関係するかもしれません．

Ref.

ここに書かれた方法を初めて用いたのは，以下の論文です．
Johnson, K.P., Yoshizawa, K. & Smith, V.S. 2004. Multiple origins of parasitism in lice. Proceedings of the Royal Society of London (B) 271 (1550): 1771-1776.